油氣田開發(fā)過程中的油井泄漏、原油管線以及儲(chǔ)油罐泄漏、海洋溢油等造成石油類物質(zhì)落于地面土壤之上，造成土壤污染，特別是海洋溢油，對(duì)海岸線和海洋造成破壞性的影響。

關(guān)于泄漏石油毒性尤其是對(duì)土壤環(huán)境的污染，一直是眾多研究團(tuán)隊(duì)關(guān)注的焦點(diǎn)。眾多研究表明，土壤中含油量對(duì)于其中生物如細(xì)菌、蚯蚓和植物均會(huì)產(chǎn)生毒害作用，含量為1%時(shí)，細(xì)菌的抑制率接近100%;含量2%對(duì)于蚯蚓毒害作用可達(dá)10.57%，7d后蚯蚓的死亡率為90%;含油量大于3%的土壤中沒有蚯蚓存活;在含油量為3%的土壤中，植物的萌發(fā)過程受到抑制，玉米和小麥的發(fā)芽抑制率分別為51.3%和48.4%。根系生長(zhǎng)也表現(xiàn)出類似的趨勢(shì)，即高濃度的石油抑制根系生長(zhǎng)。

因此，迫切需要研究有利于環(huán)境的修復(fù)方法以去除土壤中的石油污染物。到目前為止，有多種可用于石油污染土壤的修復(fù)技術(shù)，從應(yīng)用技術(shù)如溶劑萃取、生物修復(fù)，到新興技術(shù)如電動(dòng)修復(fù)技術(shù)、超聲波修復(fù)技術(shù)。而生物技術(shù)因其投資低、環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)小、適應(yīng)能力強(qiáng)被認(rèn)為是最有前途的修復(fù)技術(shù)之一。

所謂生物修復(fù)是通過供給細(xì)菌所需的營(yíng)養(yǎng)、氧氣，并調(diào)控外界條件(如pH、溫度等參數(shù))，以加速土壤中石油烴的降解。

生物修復(fù)油污土壤始于20世紀(jì)40年代，其推廣普及始于生物用于修復(fù)80年代瓦爾迪茲號(hào)漏油事件形成的油污土壤。表1顯示了迄今為止在石油污染土壤修復(fù)中的生物修復(fù)研究。目前所應(yīng)用的生物修復(fù)技術(shù)從原理上可分為三類，即生物強(qiáng)化、生物刺激和生物通風(fēng)。

1.1 生物強(qiáng)化

生物強(qiáng)化是指通過添加特定代謝活性基因工程菌以提高微生物種群的性能，增加土壤中原油降解效率。

生物強(qiáng)化關(guān)鍵是選擇生理和代謝能力強(qiáng)的微生物作為工程菌，因此土著微生物就顯得至關(guān)重要。實(shí)際土壤修復(fù)中，如果環(huán)境條件不是限制因素，土著微生物可以完成石油類污染物的自然衰減。在受污染的場(chǎng)地獲取這些微生物，并通過與場(chǎng)地類似的條件富集培養(yǎng)得到的土著微生物，能更好地降解石油污染物，Ｒoy等通過控制環(huán)境條件，利用土著原油降解菌降解土壤中的石油，經(jīng)過24w的測(cè)試，在細(xì)菌和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)共同作用下原油降解率達(dá)到80%(初始污染體積分?jǐn)?shù)為2%)。因此對(duì)于生物強(qiáng)化來說，通過篩選土著微生物，經(jīng)過富集培養(yǎng)再進(jìn)行接種是目前常用的修復(fù)技術(shù)。

1.2 生物刺激

前述表明，土著微生物在土壤修復(fù)中有重要作用，因此在條件允許下，如何提高土著微生物菌團(tuán)降解活力亦是油污土壤生物修復(fù)的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，生物刺激就是基于這一原則進(jìn)行研究。所謂生物刺激是指通過調(diào)節(jié)環(huán)境參數(shù)(如添加肥料等營(yíng)養(yǎng)成分、調(diào)節(jié)pH、添加藥劑改善油和土壤吸附性能等)用于刺激土著石油降解微生物的生長(zhǎng)，從而提高現(xiàn)場(chǎng)天然微生物降解速率。

目前生物刺激主要手段包括添加營(yíng)養(yǎng)鹽和表面活性劑。營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)于土壤中石油污染物生物降解的影響是明顯的，Chaineau等對(duì)比施肥和未施肥土壤為期150d的石油類污染物降解效果，添加氮、磷、鉀營(yíng)養(yǎng)鹽土壤中石油降解率最高為62%，未施肥的土壤降解率僅為47%。Abed等人也通過實(shí)驗(yàn)得到了類似的結(jié)果。

上述原因在于添加營(yíng)養(yǎng)鹽成功影響生物刺激，溫度升高會(huì)進(jìn)一步刺激在沙漠土壤嗜石油降解菌的活性，而未加營(yíng)養(yǎng)鹽組由于溫度提高導(dǎo)致水分的揮發(fā)致使鹽度升高，則可能造成氧氣和碳?xì)浠衔锏娜芙舛雀淖?，從而減緩細(xì)菌的生長(zhǎng)和降解能力。Emami等的研究表明，營(yíng)養(yǎng)鹽的類型在石油降解中也起到重要作用，不同形態(tài)氮肥(NO3－N和NH4－N)對(duì)污染土壤中石油的去除有不同的影響，結(jié)果表明NH4－N具有更好的除油效率，分析其原因在于其能使土壤提高植物發(fā)芽能力和增加植物呼吸值。用于石油降解的肥料種類不限于氮肥，目前的研究還表明，各種生物垃圾包括大豆餅、家禽糞便、油棕櫚果和甘蔗渣、已成功地制作成肥料應(yīng)用于石油污染土壤的生物修復(fù)。               

無(wú)毒性和可生物降解性的生物表面活性劑是生物刺激研究的另一個(gè)方向，其通過分散石油增加微生物底物的生物利用度，并能增加細(xì)胞表面的疏水性，使疏水底物自由地與細(xì)菌細(xì)胞相互作用，從而加速生物降解能力。目前研究最多的表面活性劑是長(zhǎng)效β－環(huán)糊精和鼠李糖脂，Gruiz采用長(zhǎng)效β－環(huán)糊精修復(fù)柴油和礦物油濃度分別為46290和47170mg/kg的污染土壤，與空白對(duì)比去除率分別提高了2.6%和4.8%。同時(shí)研究表明其可以減少土壤毒性并增強(qiáng)植物根系的進(jìn)一步增長(zhǎng)，增長(zhǎng)長(zhǎng)度大約為5～20mm。

1.3 生物通風(fēng)

生物通風(fēng)實(shí)際上是生物刺激的一種，通過在土壤空隙添加氧刺激微生物的生長(zhǎng)。氧氣的存在對(duì)微生物生存是必要的，因?yàn)橛醒鯒l件可以提高有機(jī)物質(zhì)的代謝，產(chǎn)生更多的能量。Thomé等人采用生物通風(fēng)修復(fù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的柴油燃料污染的土壤，經(jīng)過60d的處理，最大的降解效率為85%，而自然衰減的效率為64%，這表明氧氣流能夠增強(qiáng)微生物活性和增加污染物的降解率。

前述研究表明通過生物強(qiáng)化、生物刺激和生物通風(fēng)等手段，開展油污土壤生物修復(fù)有很高的成功潛力。但也有研究表明，通過添加營(yíng)養(yǎng)素/外部微生物未必增加除油效率，通過投加水溶性營(yíng)養(yǎng)素處理特拉華灣岸線上原油，與自然衰減相比，油去除率沒有明顯提高，原因在于該地區(qū)土壤氮含量高，足以支持生物降解石油。因此通過生物修復(fù)土壤三種機(jī)制控制條件分析對(duì)比，量身定制生物修復(fù)計(jì)劃對(duì)于油污土壤修復(fù)是必要的。

石油污染土壤生物修復(fù)的應(yīng)用已被廣泛研究，到目前為止，有許多在實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)規(guī)模研究的生物修復(fù)技術(shù)。這些技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)在于，可在原位和易地修復(fù)石油污染土壤，降解石油污染物的同時(shí)不會(huì)留下任何對(duì)環(huán)境不利的長(zhǎng)期毒素影響。此外，生物修復(fù)方法成本低，對(duì)環(huán)境沒有破壞，其美觀和低成本亦被社會(huì)廣泛接受。但其缺點(diǎn)亦明顯，一是治理時(shí)間長(zhǎng)，有些修復(fù)需要持續(xù)長(zhǎng)達(dá)幾年的治理，才能獲得令人滿意的去除結(jié)果。二是高濃度的石油污染物影響微生物群落的活動(dòng)將導(dǎo)致低的去除效率。

Margesin等人報(bào)道，當(dāng)土壤中初始柴油污染從2500mg/kg增加到20000mg/kg時(shí)，土壤中總石油烴去除率下降60%，降解效率下降的原因在于高含油量導(dǎo)致土壤環(huán)境的高毒性，不利于微生物的活動(dòng)。另外，生物技術(shù)高度依賴污染土壤參數(shù)和氣候參數(shù)，如溫度、pH、鹽度、污染物成分、濃度和風(fēng)化作用的影響。例如，高溫會(huì)影響微生物的濃度，而土壤極端pH值可能對(duì)細(xì)菌和/或真菌有毒害作用。石油的風(fēng)化作用也影響生物修復(fù)的效率。            

3.1 高效降解菌劑開發(fā)

生物修復(fù)關(guān)鍵在于適宜的微生物，不同的生物在不同受污染的場(chǎng)地活性并不相同，因此進(jìn)行生物修復(fù)成功的策略是通過實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)選擇接種的微生物。對(duì)于原地作業(yè)，生物修復(fù)前通過篩選微生物進(jìn)行接種能夠增加成功的機(jī)率。目前土壤修復(fù)生物篩選最成功的方法是Kim等提出的DNA診斷———寡核苷酸微陣列方法，其通過原位診斷檢測(cè)適合該地點(diǎn)修復(fù)的微生物菌株，用于原位土壤修復(fù)。

從DNA診斷結(jié)果表明，污染土壤的修復(fù)可以成功實(shí)施，通過這種診斷將能夠減少許多試驗(yàn)和錯(cuò)誤，因?yàn)樗梢源_定生物修復(fù)的候選位點(diǎn)，同時(shí)評(píng)估生物修復(fù)的進(jìn)展。其次在進(jìn)行生物菌劑修復(fù)同時(shí)，開展石油對(duì)微生物降解影響的研究，對(duì)于菌種篩選也具有重要意義。

研究表明，微生物與油類污染物長(zhǎng)期相互作用將改變微生物某些特性，如細(xì)菌與柴油長(zhǎng)期接觸后，二者相互作用會(huì)產(chǎn)生天然柴油表面活性劑，主要是由于疏水性，與柴油表面活性劑的相互作用后，Zeta電位和脂肪酸發(fā)生顯著變化，從而影響了遺傳修飾編碼基因成分，導(dǎo)致對(duì)長(zhǎng)期受到石油污染物作用后的細(xì)菌遺傳物質(zhì)產(chǎn)生影響。其次原油也會(huì)對(duì)微生物生物量、組成和功能產(chǎn)生影響，通過元蛋白質(zhì)組分析來確定石油污染和微生物群落之間的功能和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，能夠加深對(duì)生物降解機(jī)理的認(rèn)識(shí)，從而從遺傳學(xué)、基因?qū)W等角度篩選合適的菌劑。

3.2 環(huán)保的營(yíng)養(yǎng)添加劑

無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的加入，能夠成功地協(xié)助生物修復(fù)，但這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)浸出到地下水或任何水源，會(huì)導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，對(duì)水質(zhì)產(chǎn)生不利的影響。因此尋找這些無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)素的替代是研究熱點(diǎn)，目前研究集中在直接加入植物或動(dòng)物的有機(jī)物質(zhì)代替無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽。Horel等研究了植物(互花米草)和魚組織(鯖森的突起部分)作為營(yíng)養(yǎng)添加劑處理亞熱帶沉積物風(fēng)化的柴油，42d后添加魚組織油降解率提高104%，添加氮磷無(wú)機(jī)養(yǎng)分降解率提高了57%，植物有機(jī)質(zhì)降解率提高7%。由此可見，添加動(dòng)物基有機(jī)材料可以提高烴降解率，因此如何因地制宜地選擇合適的營(yíng)養(yǎng)添加物對(duì)于土壤修復(fù)成功具有一定的意義。

其次各種易降解的、產(chǎn)生較低毒性的、高溫和堿性條件下能保持穩(wěn)定的生物表面活性劑也是研究熱點(diǎn)。目前的研究都集中在尋找新的促進(jìn)石油烴降解的生物表面活性劑，Ayed等已成功地從一株芽孢桿菌分離出生物表面活性劑，對(duì)于溫度、pH值、鹽度具有較強(qiáng)適應(yīng)性，同時(shí)對(duì)柴油的溶解度分別比SDS和吐溫80提高10%，生物降解效率提高30%。這表明生物菌株分離的表面活性劑在石油污染土壤的生物修復(fù)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

3.3 生物修復(fù)新技術(shù)

研究生物修復(fù)的效率受以下參數(shù)影響:石油降解微生物;營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如溶解氧、氮和磷等;環(huán)境因素。因此，當(dāng)前石油污染修復(fù)工程著重獲得最佳除油效率的操作參數(shù)，響應(yīng)面法是優(yōu)化生物過程的有效方法，lvarez等通過響應(yīng)面法優(yōu)化南極的石油污染土壤生物修復(fù)參數(shù)，優(yōu)化后C∶N∶P=100∶17.6∶1.73，柴油去除率達(dá)到54.9%，而在未經(jīng)優(yōu)化的C∶N∶P比為100∶10∶1的去除率僅為27.8%，同時(shí)通過優(yōu)化能夠減少肥料用量?？梢婍憫?yīng)面法對(duì)于生物修復(fù)土壤參數(shù)優(yōu)化具有重要作用，下一步應(yīng)該進(jìn)一步優(yōu)化響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化修復(fù)參數(shù)的適應(yīng)性。同時(shí)厭氧生物修復(fù)技術(shù)目前也獲得世界各地研究人員的青睞。

厭氧生物修復(fù)技術(shù)是微生物通過利用硝酸鹽、硫酸鹽、鐵和二氧化碳作為電子受體修復(fù)石油污染土壤，相比于好氧生物修復(fù)工程向污染場(chǎng)地提供氧源而造成的高成本，這是一個(gè)符合經(jīng)濟(jì)效益的方法。通過對(duì)比硫酸鹽、硝酸鹽、甲烷和混合電子受體的條件下柴油(550mg/kg)污染土壤原位生物修復(fù)效率，表明混合電子受體條件下柴油降解效率達(dá)到81%，而單獨(dú)硫酸鹽或者硝酸鹽還原條件時(shí)柴油降解效率低于50%。這可能是由于在混合電子受體條件下細(xì)菌含量高所致。而對(duì)于不同電子受體混合條件，混合比例以及混合后降解機(jī)理研究相對(duì)較少。      

1）生物修復(fù)能夠有效降解石油污染物，并不會(huì)留下任何對(duì)環(huán)境不利的長(zhǎng)期的毒性影響，且其成本低，能夠永久消除污染物并且不破壞環(huán)境;然而，這些技術(shù)需要長(zhǎng)達(dá)幾年的持續(xù)時(shí)間治理，才能獲得令人滿意的去除結(jié)果。同時(shí)，高濃度的石油污染物以及不利環(huán)境條件會(huì)降低微生物群落的活性，也會(huì)導(dǎo)致低的去除效率。

2）未來的工作應(yīng)在特種微生物和轉(zhuǎn)基因微生物開展研究，通過DNA診斷方法，從遺傳學(xué)、基因?qū)W等角度篩選合適的菌劑開展生物修復(fù)。

3）開發(fā)更環(huán)保的營(yíng)養(yǎng)添加劑以及更規(guī)范的生物修復(fù)參數(shù)將成為未來研究工作的重點(diǎn)。

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